“ 肿瘤微环境中靶点蛋白表达水平，浸润的T细胞，及其他类型的免疫细胞与免疫检查点抑制剂（ICI）的应答密切相关。利用测序等生物信息学方法建立模型预测ICI的响应” 

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PD-L1表达 

预计PD-L1的表达对Anti-PD-L1或anti-PD1的治疗有一定的作用。因此，免疫组织化学(IHC)检测PD-L1蛋白的表达已被应用于临床。目前，FDA已批准PD-L1IHC作为NSCLC患者anti-PD1治疗的配套诊断。例如，pbrobrolizumab被批准用于PD-L1非小细胞肺癌患者(定义为PD-L1，至少50%的肿瘤细胞用于一线使用，至少1%用于二线使用)。尽管如此，PD-L1的表达仍然是免疫检查点抑制剂（ICI）反应一个不完全的预测因子。对多种肿瘤类型的多项研究发现PD-L1的表达与ICI反应或OS呈正相关，而其他研究则未发现相关性（如头颈部肿瘤等）。

PD-L1生物标志物研究结果矛盾的潜在原因包括使用不同的检测方法、PD-L1表达的时态和ITH以及评估阳性程度的非标准化标准，例如PD-L1相对染色强度，和百分比等。此外，即使PD-L1的表达与反应相关，也有许多低到无PD-L1表达的患者经历了持久的临床受益。因此，PD-L1状态可能不是临床治疗决策的一个足够全面的独立生物标记物。重要的是，一项对联合使用anti-CTLA 4和anti-PD1的非小细胞肺癌患者的研究发现，PD-L1染色和TMB是独立的反应预测指标，包含这两种因素的多变量模型提高了预测的敏感性和特异性。最近，在keynote189三期临床试验中，有报道说PD-L1水平可能是在NSCLC患者一线治疗中对pembrolizumab单抗加化疗的反应的预测。研究人员观察到，PD-L1在各级表达水平上，对免疫治疗加化疗方案的应答者的PD-L1表达增强，但随着PD-L1阈值的放宽，PD-L1阳性表达的预测作用明显减弱。作为另一个重要的警告，一些研究发现PD-L1表达的细胞类型也应该考虑到。在黑色素瘤和尿路上皮癌患者的独立队列中，发现PD1在肿瘤浸润的免疫细胞上的表达，而在肿瘤细胞本身上不表达，分别与抗PD1和抗PDL1的反应有关。 

02 

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肿瘤浸润淋巴细胞：密度、表型和多样性 

人们认为，免疫检查点抑制剂（ICI）治疗，特别是anti-PD1和anti-PD-L1，部分是通过激活已有的肿瘤免疫应答起作用的。因此，ICI反应的另一个潜在预测因素是肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的密度。事实上，TIL密度是一些肿瘤类型的强阳性预后指标，而不考虑ICI治疗。例如，一种被称为免疫核心的指标，涉及对肿瘤中心和周围的CD8 T细胞进行量化，是OS的一个强有力的预测因子，可以补充CRC中传统的肿瘤淋巴结转移(TNM)分期或MSI状态。值得注意的是，单细胞测序显示CD4记忆T细胞也在对ICI 有反应的人类黑色素瘤中富集。在抗PD1治疗的背景下，据报道，IHC在肿瘤侵袭性边缘测量的TIL密度与抗-PD1反应密切相关，这种方法可能很有前途，但很难标准化，需要更多的数据来说明该方法的通用性。

越来越多的证据表明，影响ICI结果的不仅仅是TIL的位置和密度，还有TIL的表型。例如，虽然抗PD1治疗后，抗CTLA 4的患者TIL浓度没有明显变化，但应答与T效应细胞活性指标CYT 50(以穿孔素1(PRF 1)和颗粒酶转录水平54的几何平均数计算)的增加有关。值得注意的是，不论肿瘤类型如何，CYT与tmb都有显著的相关性，这支持了这样的观点，即癌症的免疫控制涉及T细胞介导的对来自nssnv的肿瘤新抗原的溶细胞反应。

除了T效应细胞活化表型外，其他T细胞表型标记也与ICI反应相关。例如，TIL表面表达的PD1水平可能与抗肿瘤免疫反应的效果有关。具体来说，对非小细胞肺癌患者TIL的分析显示，在PD1表达的基础上，有三种不同的CD8 T细胞。PD1表达最高的肿瘤群体称为PD1Tumour(PD1T)，因为PD1T与慢性病毒感染相关的PD1hi细胞在转录上明显不同。在三个分离的CD8 T细胞群中，只有PD1T细胞能够在体外对自体肿瘤细胞产生细胞因子反应，这表明该细胞群在肿瘤抗原特异性T细胞中富集。重要的是，治疗前PD1T细胞水平与抗PD1应答呈正相关；然而，这些结果仍有待于验证队列的验证。相反，在小鼠体内的研究表明，由于Treg细胞相互作用、染色质重塑或转录重组，在慢性抗原暴露下，PD1高表达的T细胞可能表现出不可逆转的耗竭表型。此外，一项对HNSCC患者的研究发现，高PD1表达的肿瘤内T细胞百分比与切除后PFS 差直接相关，但这些患者未接受ICI治疗，而HPV状态可能是HNSCC的一个混杂变量。另一项针对抗PD1治疗的非小细胞肺癌患者的研究发现，肿瘤和外周血中积累的CD4 FOXP 3−PD1hi T细胞(4PD1hi)是肿瘤负荷的一种功能。重要的是，治疗时外周血4PD1hi细胞计数的下降与这个队列中OS的改善显著相关。NSCLC相关的PD1T细胞的一个独特的特征是它们表达趋化因子CXCL13，它专门招募B和T滤泡辅助(TFH)细胞。CXCL 13-TFH细胞-B细胞轴曾被证明与非ICI治疗的CRC患者的长期存活有关。虽然人们普遍认为B细胞和TFH细胞不是抗肿瘤免疫应答的主要成分，但这些发现表明肿瘤微环境的这一部分可能需要在ICI反应的背景下进一步研究。

应用新的单细胞RNA测序(scRNA-seq)平台允许高分辨率的表型特征，这是不可能的批量测序方法。对32例经ICIS治疗的转移性黑色素瘤患者的单细胞转录组数据进行了非监督聚类，确定了两种主要的肿瘤内CD8 T细胞表型：记忆型和疲劳型。记忆样TILs与疲劳TIL的比值与免疫检查点抑制剂（ICIS）的反应密切相关.此外，还发现转录因子Tcf 7在具有记忆样表型的T细胞中被选择性表达。因此，CD8 tcf 7和CD8 tcf 7−TIL的比值与抗-pd 1治疗的黑色素瘤患者的应答和生存密切相关，即使在总T细胞浸润没有明显差异的情况下也是如此。

一种有效的T细胞反应涉及特异性抗原反应T细胞克隆的激活和扩增.因此，肿瘤内或外周T细胞库的克隆结构可能是与ICI反应相关的肿瘤免疫原性的另一个指标。T细胞库多样性可以用两种互补指标来量化：丰富度，即独特的TCR序列数和克隆性，即序列分布的均匀性(低克隆性表示所有克隆的分布相等，高克隆性表示倾斜或寡克隆群体，少数克隆占主导地位)。肿瘤内或外周T细胞的多样性与ICI反应之间的关系似乎是复杂的，因为一些研究发现治疗前或治疗后的克隆性水平与反应呈正相关，而另一些研究表明，只有在治疗中增加克隆性与抗-PD1应答相关。另一项针对30例黑色素瘤患者的研究发现，TIL多样性与抗-PD1反应或存活无关，但没有检测治疗后的变化。有趣的是，一项对29例经抗PDL 1治疗的尿路上皮癌患者的研究发现，治疗前外周T细胞克隆性与PFS和OS呈负相关，而T细胞内克隆性与生存期无相关性。同样，一项对25例转移性胰腺癌患者的研究发现，抗CTLA 4治疗的患者外周血T细胞克隆性与生存呈负相关，但与抗PD1无关。更复杂的是，先前的免疫治疗暴露可能会影响T细胞储备动力学在随后的抗-PD1的使用。具体来说，在治疗中，抗CTLA4治疗的黑色素瘤患者体内T细胞丰富度的增加与抗PD1反应有关，而T细胞克隆性的增加与免疫治疗中的抗PD1反应有关。这些结果表明，需要做更多的工作来阐明肿瘤内和外周T细胞多样性作为ICI反应指标的效用。 

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肿瘤微环境不只有T细胞 

许多其他类型的免疫细胞可能影响ICI的疗效。虽然目前还没有通过FDA批准的检测方法来预测免疫检查点抑制剂（ICI）的疗效，但目前正在做的工作是破译这些细胞类型对应答率的影响。为了更全面地了解肿瘤的免疫微环境，从RNA测序结果中提取免疫细胞表型和丰度数据的方法已经发展成。这种计算被应用于治疗前和治疗后黑色素瘤患者的肿瘤样本，发现抗-PD1反应与CD8 T细胞和自然杀伤细胞的增加和巨噬细胞的减少有关。这一补充数据提示髓系细胞在ICI反应中具有潜在的抑制作用。在一组独立的黑色素瘤患者中，肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)与不良的抗PD1反应之间存在类似的相关性。

此外，在黑色素瘤患者中，骨髓源性抑制细胞(MDSCs)的低分化群体的外周血水平与抗CTLA 4反应不佳有关。事实上，在一项利用机器学习来识别所有TCGA肿瘤样本CYT预测参数的研究中，最关键的特征之一是缺乏MDSC 。该模型的另一个主要特征是CD8 T细胞、γδT细胞和自然杀伤细胞的富集，以及Treg细胞的耗竭。值得注意的是，免疫表型核心在两组独立的ICI患者中区分应答者和非应答者的敏感性和特异性都很高。在一项对肾癌患者的独立研究中，在接受抗-PDL 1的患者中，高的瘤内髓样信号与PFS中位数下降近有关，再次强调髓系细胞对ICI反应的抑制作用。值得注意的是，联合使用VEGF抑制剂可使髓细胞含量高的肿瘤患者的中位pfs增加8倍以上，这表明髓系信号可能是选择RCC患者联合治疗的有用的生物标记物。

髓系细胞的特异性亚群可能在调节T细胞排斥中起重要作用。据报道，LY6ClowF4/80巨噬细胞可调节T细胞对胰腺癌的排斥作用。这些巨噬细胞位于肿瘤微环境之外，它们协调了获得性T细胞免疫特权的位点，并消除了它们，提高了免疫治疗诱导T细胞依赖性肿瘤杀伤的能力。总之，对肿瘤微环境的检查显示出作为ICI疗效的预测生物标记物的巨大前景。 

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转录和表观遗传标记 

RNA测序数据的生物信息学分析已被用于揭示与ICI反应或耐药性相关的全球肿瘤和微环境特征。一项研究确定了治疗前的特征，包括28个黑色素瘤患者组中与抗PD1抵抗相关的26个转录亚信号。然而，在另外两个独立的黑色素瘤组中，这一特征与抗CTLA 4或抗PD1反应无关，这表明它可能反映了分析过的原始队列特有的特征。另一项对抗PD1治疗的黑色素瘤患者的研究发现，治疗前RNA表达特征与肿瘤克隆结构的治疗改变有关。据推测，由于肿瘤克隆结构的改变与反应和OS有关，治疗前的RNA信号也可能是治疗结果的预测。事实上，这一RNA特征与改善两个独立黑色素瘤组的存活率有关，其中一个只使用抗PD1，另一个用抗CTLA 4或抗PD1治疗。

初步数据表明，这种炎症基因特征在预测肿瘤类型中具有预测价值。最近的工作已经利用单细胞转录组分析精细的细胞分辨率来确定与T细胞排斥相关的肿瘤细胞转录程序。这一特征是预测不良的ICI反应和降低生存率在多个独立的黑色素瘤患者队列。值得注意的是，体外实验表明CDK 4和CDK 6抑制可以逆转这种T细胞排斥方案，从而为表达这一转录程序的肿瘤患者提供了一种潜在的联合策略。

除了基因组和转录特征外，表观遗传改变也可能与对ICIS的反应有关。利用DNA甲基化微阵列，与ICI反应相关的表观遗传标记在NSCLC患者的独立队列中被识别和验证。此外，单个基因FOXP3的甲基化状态也可以预测ICI的应答。

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