PD-1及CTLA-4等免疫检查点近些年来在抗肿瘤治疗中进展火热，但是在单一免疫检查点疗法中往往仅有10%到30%左右的病人病情能够得到有效缓解，其耐药机制仍是目前需要仔细探索的。为了突破这一瓶颈，以PD-1单抗为代表的相关免疫治疗常常会与其他免疫检查点抗体药物联用以求取得更显著的治疗效果。LAG3（Lymphocyte activation gene-3）是一种免疫检查点受体蛋白，主要表达在活化的T细胞、NK细胞、B细胞、浆细胞和树突细胞，有研究表明在一些小鼠肿瘤模型的瘤内T细胞中其PD-1表达的同时也高表达LAG3，而这类抑制分子常在调节性T细胞（Tregs）和耗竭的CD8+ T细胞上共表达，从而一定程度的抑制免疫反应的发生[1]。故与单一疗法相比，LAG3与PD-1双靶点共抑制可以有效增强CD4+及CD8+T 细胞的浸润能力，T细胞其他功能也有所提高，这些显著的成果使得将二者联用的治疗方法在临床研究中成为又一热点。 LAG3与CD4在结构上类似，含有4个胞外免疫球蛋白超家族类似结构域，这些胞外域是与配体结合是传达T细胞抑制信号所必需的。金属蛋白酶ADAM10/17（a disintegrin and metalloproteionase domain-containing protein 10/17）可以裂解LAG3，使其胞外端脱落形成一种单体可溶性的LAG3（sLAG3）。有研究表明，如果使得LAG3不被ADAM10/17裂解，T细胞在体外的活性被明显抑制从而影响其在增殖及细胞因子分泌等的功能削弱[2]，但LAG3的脱落在体内对免疫相关治疗的影响尚不明确。
为了研究这一问题，美国匹兹堡大学医学院的Lawrence P. Andrews团队建立了一种T细胞表达不可裂解形式LAG3（LAG3NC）的转基因小鼠模型，在该模型上他们进行了一系列关于LAG3脱落对抗肿瘤效果影响的实验并于近日发表在了Science Immunology上，该文章揭示了LAG3的脱落在LAG3抑制信号通路中的重要地位，这对免疫疗法的发展有积极作用。
为了评估T细胞上LAG3脱落对免疫反应的影响，Lawrence P. Andrews团队选用了Cre-loxP重组酶系统来构建转基因小鼠模型。对LAG3序列在位于胞外结构域D4与跨膜蛋白结构域之间的Lag3 exon 7中特定区域两端插入LoxP位点，再将表达该LAG3突变的Lag3NC.L/L小鼠与携带不同Cre重组酶的小鼠杂交，从而建立出在特定细胞类型上表达LAG3NC的小鼠来探究不同种类T细胞对LAG3脱落的反应，最终得到Lag3NC.L/LCD4Cre（全部T细胞表达LAG3NC）、Lag3NC.L/LE8ICre.GFP（仅CD8+细胞表达）、Lag3NC.L/LThPOKCreERT2（仅CD4+细胞表达）及Lag3NC.L/LFoxp3CreERT2.GFP（仅Tregs细胞表达）这四种类型的小鼠。
研究人员分别在Lag3NC.L/L和Lag3NC.L/LCD4Cre两种不同小鼠品系上接种MC38及B16-F10肿瘤细胞，他们发现两个品系小鼠体内的肿瘤生长情况并无显著不同，CD4+细胞及CD8+细胞的增殖死亡情况等也并无差异。随后，他们使用这两种小鼠品系进行PD-1抗体的免疫治疗研究，有趣的现象发生了，Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠对PD-1抗体的敏感性显著降低，肿瘤清除的效果不如Lag3NC.L/L小鼠。为验证该结论不仅局限与该肿瘤模型，Lawrence等人在这些小鼠体内建立了另外两种不同的肿瘤模型：（1）在小鼠首次皮下接种MC38第12天切除肿瘤组织，一个月后再次接种MC38细胞评估两种小鼠对肿瘤清除能力；（2）小鼠接种过表达gp100的B16肿瘤细胞后，选用抗PD-1药物和Amph-vax/Amph-E7联合给药评估药物的抑瘤效果。结果显示，Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠的抗肿瘤效果明显较弱（图1），这些现象均能证明T细胞上LAG3NC的表达能够影响肿瘤的清除。
图1. LAG3NC抑制体内的抗肿瘤作用
为了进一步确定LAG3的脱落是否影响CD4+T细胞群体的功能，研究人员选用上文所提到的几种不同的小鼠品系建立肿瘤模型并对肿瘤细胞浸润细胞（TILs）功能性进行了检测，LAG3胞外段的不可裂解并没有对CD8+T细胞或Tregs细胞造成较为明显的影响，反而是常规CD4+T细胞（Tconv细胞）的功能性（如IFN-γ，TNF-α和IL-2等细胞因子的分泌）和增殖受到了抑制（图2）。除此之外，实验性自身免疫脑脊髓炎（简称EAE，一种CD4+T 细胞介导为主的自身免疫性疾病）也作为了一种有效模型来评估LAG3NC对T细胞的影响，Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠的EAE严重程度与Lag3NC.L/LE8ICre.GFP小鼠/Lag3NC.L/L小鼠相比明显较弱。这些数据表明了受LAG3NC调控的Tconv细胞在肿瘤免疫中有着重要的地位，LAG3NC本质影响的是Tconv细胞。 图2. LAG3NC影响T细胞功能
那么CD8+T细胞呢？LAG3的脱落是否也会影响其功能呢？答案是肯定的，但这种影响并不是内在的，而是外在的。研究人员在Lag3NC.L/LE8ICre.GFP小鼠及Lag3NC.L/L小鼠上建立了肿瘤模型并对比了它们对PD-1单抗的敏感性，结果显示二者之间并没有明显的药效差异。同时，他们还对CD8+TILs的功能性进行了分析，从Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠分离出的TILs在经过PD-1抗体治疗后其CD8+T细胞的TNF-α及IFN-γ释放能力明显减弱，而Lag3NC.L/LE8ICre.GFP小鼠体内的CD8+ TILs功能性却与对照组没有大的差异（图3），这一结果揭示了一个现象：CD8+ T细胞功能的改变或许并不是通过其细胞本身的LAG3变化，而是通过Tconv细胞上的LAG3脱落所间接影响的。
图3. LAG3NC并非本质影响CD8+T细胞功能
作者的一系列实验证明了在小鼠体内，受到LAG3裂解本质上影响的是Tconv细胞而非CD8+T细胞或Treg细胞，进而使得T细胞相关的免疫反应受到限制，那么这一结论在临床上是否也依然站得住脚呢？为了解决这一问题，研究人员针对LAG3与ADAM10的表达之间的关系进行了研究。通过对来自首次治疗转移性黑色素瘤病人的新鲜肿瘤组织及外周血淋巴细胞（PBLs）进行分析，他们发现与健康人的外周血淋巴细胞相比，患病者的PBLs有更多的LAG3和ADAM10表达，但二者之间的关系往往呈负相关性。为进一步确定这一规律的可靠性，他们又获取了一些已经接受了免疫治疗的晚期转移性黑色素瘤患者及其他皮肤癌患者的样本（包含对免疫治疗有响应与无响应的）进行同样地分析，其中无应答者的Tconv细胞LAG3表达明显升高但ADAM10的表达减弱。这表明Tconv细胞上LAG3：ADAM10表达比例的高低可以一定程度的帮助判断PD-1等免疫疗法的成功与否。
虽然这篇文章告知了我们Tconv细胞上LAG3表达对免疫疗法的重要性，但与Tconv细胞相比，耗竭的CD8+T 细胞与Tregs表面的LAG3始终保持着高水平的表达[3]，难道ADAM10这些金属蛋白酶就不能使得它们表面的LAG3脱落吗？如果能，这些细胞上LAG3的脱落也能够重振免疫反应吗？怎么做能够辅助这些LAG3的脱落？这些问题的答案尚不得知，LAG3脱落对T细胞的抑制作用的解除机制仍需进一步研究探索。目前已有多个免疫相关的临床研究选择与LAG3靶点药物联合治疗，所以对LAG3抑制信号通路的理解显得尤为重要，Lawrence P. Andrews团队对LAG3脱落机制的发现为其相关的免疫研究提供了新的思路。相信在不久的将来随着人们对免疫检查点的深入研究，目前所面临的难关必能顺利地逐一突破。
Reference：
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[2]. N. Li, C. J. Workman, S. M. Martin, D. A. Vignali, Biochemical analysis of the regulatory T cell protein lymphocyte activation gene-3 (LAG-3; CD223). J. Immunol. 173, 6806–6812 (2004).
[3]. L. P. Andrews, A. E. Marciscano, C. G. Drake, D. A. Vignali, LAG3 (CD223) as a cancer immunotherapy target. Immunol. Rev. 276, 80–96 (2017).
[4]. L. P. Andrews, A. Somasundaram, J. M. Moskovitz, A. L. Szymczak-Workman, C. Liu, A. R. Cillo, H. Lin, D. P. Normolle, K. D. Moynihan, I. Taniuchi, D. J. Irvine, J. M. Kirkwood, E. J. Lipson, R. L. Ferris, T. C. Bruno, C. J. Workman, D. A. A. Vignali, Resistance to PD1 blockade in the absence of metalloprotease-mediated LAG3 shedding. Sci. Immunol. 5, eabc2728 (2020).
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