前言 毒理学研究是药物非临床安全性评价的重要内容，临床前毒理数据有助于我们了解药物的毒理学特征，从而进行科学合理的设计，并为药物临床试验开发提供重要依据，最大可能降低药物副作用或临床风险，对于创新药开发来说至关重要。 毒理试验中，毒理剂量是试验设计的核心内容，今天就来盘点一下各国指导原则中对毒理学剂量设计的要求和建议。
—— 01 —— NMPA《药物单次给药毒性技术指导原则》
单次给药毒性试验的重点在于观察动物出现的毒性反应。单次给药毒性试验的试验方法较多，常用的试验方法有近似致死量法、最大给药量法（注释1）、最大耐受量法法（注释2）、固定剂量法、上下法（序贯法）、累积剂量法（金字塔法）、半数致死量法（注释3）等。应根据受试物的特点选择合适的方法，根据不同的试验方法选择合适的剂量。原则上，给药剂量应包括从未见毒性反应的剂量到出现严重毒性反应的剂量，或达到最大给药量。
—— 02 —— NMPA《药物重复给药毒性试验技术指导原则》
《药物重复给药毒性试验技术指导原则》中指出：重复给药毒性试验原则上至少应设低、中、高 3个剂量组，以及1个溶媒（或辅料）对照组，必要时设立空白对照组和/或阳性对照组；高剂量原则上使动物产生明显的毒性反应，低剂量原则上相当或高于动物药效剂量或临床使用剂量的等效剂量，中剂量应结合毒性作用机制和特点在高剂量和低剂量之间设立，以考察毒性的剂量-反应关系。剂量设计应考虑之前进行的各项试验所评价的终点、受试物的理化性质和生物利用度等；局部给药应保证充分的接触时间。高剂量应出现明显毒性反应，或达到最大给药量（Maximum Feasible Dose, MFD），或系统暴露量达到临床系统暴露量的50倍（基于AUC）。如需要在试验中途改变给药剂量，应说明剂量调整理由，完整记录剂量调整过程。
—— 03 —— ICH-S6(R1)：《生物技术药物的临床前安全性评价》
剂量选择应反应剂量-反应关系，包括毒性剂量和未见不良反应的剂量（NOAEL）。应提供剂量选择依据及其预计的人体暴露量倍数。当产品在所选动物细胞中的亲和力或效价低于人体细胞时，使用更高剂量进行试验非常重要。用于确定足够安全范围所需的人用剂量倍数，可能随生物制品的类别及其临床适应症而有所不同。此外可通过PK/PD模型提供： 1. 临床前种属预期最大药理学作用的剂量；
2. 暴露量约为临床最大暴露10倍的剂量。 在临床前毒性试验中应该选择上述两种剂量中的较高者，除非有合理的理由选用较低剂量（如最大的可行剂量）。
—— 04 —— ICH-M3(R2)：支持药物进行临床试验和上市的非临床安全性研究指导原则
通常，当毒理学试验的剂量达到最大耐受量（MTD）时，可以充分阐明具有潜在临床相关性的毒性反应。但不是每个试验都必须证明达到MTD。其他同样适当的限定剂量还包括达到最大暴露倍数的剂量、暴露饱和剂量或最大可行剂量（MFD）。这些限定剂量（详见下文和图1)可以避免在动物中使用无益于预测临床安全性的剂量。这些建议与生殖和致癌性试验设计中有关限定剂量和（或）暴露的建议是一致的。 除以下情况外，1000mg/(kgd)作为啮齿类和非啮齿类动物急性、亚急性、慢性毒性试验的限定剂量都是合适的。在个别情况下，1000mg/(kgd)的平均暴露剂量达不到临床暴露量的10倍，而临床剂量超过1g/d，毒性试验应以暴露量达到临床暴露量的10倍、2000mg/(kgd)、MFD三者中的最低者作为高剂量。在极个别情况下，2000mg/(kgd)产生的暴露量可能低于临床暴露量，此时可以考虑更高的MFD作为高剂量。 在任何种属中进行的急性和重复给药毒性试验，通常都可以接受将暴露量达到临床全身暴露50倍【通常基于原型药或前药的药理活性分子的组平均AUC】的剂量作为最高剂量。 为了支持在美国进行的III期临床试验，当以暴露量达到临床暴露量50倍的剂量作为限定剂量时，至少应在一个种属中确定剂量限制性毒性。否则，建议在一个种属中进行一项一个月或更长期限的毒性试验，以1000mg/(kg.d)、MFD、MTD三者中的最低者作为高剂量 。但是基于具体问题具体分析的原则，如果在一项期限更短的试验中在高于产生临床暴露50倍的剂量下找到了剂量限制性毒性，则无需进行该试验。 如果将遗传毒性终点整合入一般毒性试验中，那么应基于MFD、MTD或者限定剂量1000mg/(kg.d)来选择作为合适的最高剂量。 一般毒理试验高剂量选择的推荐方法详见下图： 
—— 05 —— ICH-S3A：《毒代动力学指导原则说明：毒性研究中的全身暴露量评价》
毒代动力学研究通常结合于毒性研究中，故又被称为伴随毒代动力学，药物暴露直接影响药物的药理学特性，毒代动力学揭示毒性研究中药物的动力学过程，有助于解释毒理学发现和制定合理的试验设计，ICH-S3A中对剂量设计的建议如下： 1. 低剂量：低剂量最好是无毒性反应剂量（注释 4），任何毒性试验中低 4剂量的动物暴露水平，理想状态下应等同或略高于患者拟用（或已知）的最高剂量。但该理想状态并非总是可以达到，故低剂量通常视毒理学考虑而定。无论如何应进行全身暴露量测定。
2. 中剂量：根据毒性试验目的，中剂量的暴露通常是低剂量的适当倍数或高剂量的适当分数。
3. 高剂量：毒性试验中高剂量通常依毒理学的要求而定，但所用剂量应达到可评价的暴露水平。
—— 06 —— FDA：药物单剂量急性毒性试验
FDA于1996年8月发布的《SINGLE DOSE ACUTE TOXICITY TESTING FOR PHARMACEUTICALS》中，对单次给药毒理剂量设计做出了以下建议：用于动物实验的供试品，应确定不会产生不良影响的剂量和造成重大(危及生命的)毒性的剂量。应设置对照组。对于毒性较低的化合物，应给予最大可行剂量（MFD）。 
—— 07 —— FDA：Redbook红皮书
FDA的红皮书中，对毒性试验剂量设计也给出了建议：每个性别至少应设置3个供试品剂量水平，但如果可以使用4或5个试验物质剂量水平更好。应设置对照组。毒性研究的剂量选择应基于与试验物质的毒性有关的信息。在毒性研究中，供试品应至少设置三个剂量组和一个对照组。在设计和进行毒性研究时，应考虑以下因素: 1. 高剂量应足以引起试验动物的毒性反应;
2. 低剂量不引起实验动物的毒性反应;
3. 中间剂量应足够高，能在试验动物身上引起最小的毒性作用(如改变酶水平或体重增加的轻微下降)。 任何剂量都不应造成死亡发生率，从而阻止对数据进行有意义的评估。所有剂量组应同时给予试验物质。
—— 08 —— EMA：重复给药毒性指导原则
欧盟EMA在2010年发布的《Guideline on repeated dose toxicity》中，对毒理剂量设计的建议如下： 一般来说，毒理剂量设计应包括： 1. 合适的对照组，在特殊情况下，可能需要一个阳性对照组，例如在具有特殊生物学终点的毒物研究中(例如基因毒性，请参阅指导原则ICH S2 (R1)以获得进一步指导)。
2. 一个低剂量，足以产生药效学效应或预期的治疗效果，或产生与预期临床使用时相当水平的系统暴露。
3. 一个高剂量，用以确定靶器官毒性或其他非特异性毒性，或达到给药体积限制剂量。大部分情况下，啮齿类和非啮齿类动物的急性、亚慢性和慢性毒性研究的限制剂量可设为1000mg/(kg.d)，除ICH M3 (R2)指南中讨论的其他情况。
4. 一个中剂量，可以是高剂量和低剂量的几何平均值。 理想情况下，在高剂量水平下，药物和/或主要代谢物的全身暴露应是预期临床全身暴露的一定倍数。
自2017年中国加入ICH成员国并担任管委会成员，药物国际化趋势加快，ICH指导原则全面推行，中国药政法规与国际接轨，NMPA鼓励创新，缩短了研发的周期，对于药物研发来说是非常有利的。综合各法规来看，各国对毒理试验剂量的设计要求总体一致，科学合理的毒理试验剂量设计有利于充分了解毒理学发现，预知毒理作用的出现剂量，从而为临床试验提供充分的依据，保护受试者权益，创新药物的毒理研究尤其重要，而毒理试验设计不合理，可能在药物IND注册审评阶段就遭遇发补或者更坏的结果，所以要从药物的本身特点出发，结合法规要求，同时在case-by-case的原则之上，做充分的研究。药物的药理作用有两面性，因此找到药效和毒理作用之间的安全窗口，达到风险和获益的平衡，才能最大程度发挥药物的作用。
注释： 注释1：最大给药量（Maximal feasible dose，MFD）：指动物单次或24小时内多次（2~3次）给药所采用的最大给药剂量。 注释2：最大耐受量（Maximal tolerance dose，MTD）：是指动物能够耐受的而不引起动物死亡的最高剂量。 注释3：半数致死量（Median lethal dose，LD50）：预期引起50%动物死亡的剂量，该值是经统计学处理所推算出的结果。 注释4：无毒性反应剂量：（被认为等同于“未见不良反应剂量”）定义为：在该剂量下，可能观察到某些药理学作用，但未见不良反应。
参考文献： [1] 药物单次给药毒性技术指导原则. NMPA，2014.5. [2] 药物重复给药毒性试验技术指导原则.NMPA，2014.5. [3] ICH-S6(R1)：Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals, 2011. [4] ICH-M3(R2)：Guidance on Nonclinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals,2009. [5] ICH-S3A：Note for Guidance on Toxicokinetics: The Assessment of Systemic Exposure in Toxicity Studies,1994. [6] FDA：Single Dose Acute Toxicity Testing for Pharmaceuticals, 1996. [7] Redbook 2000 IV.C, FDA 2003，2007. [8]Guideline on repeated dose toxicity, EMA 2010.3.
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