如何确定新药人体内首次给药（first in human，FIH）剂量是新药研究过程中的重要环节之一，在临床实验的过程中，FIH剂量代表着临床实验的起点，因此必须绝对安全。在FDA的指导方案中，FIH可以通过在相关物种上进行的多种药理、毒理研究得出的，“未观察到不良反应水平”（No Observable Adverse Effect Level，NOAEL）确定，此概念一般认为是临床前药理毒理实验中，在相关物种上确定的最大安全剂量。通过物种敏感度、特异性及人体适用性等相关因素可以确定NOAEL的人体等效剂量（human equivalent dose，HED），再加上特定的安全系数（safety factor）计算得出人体最大安全起始剂量（human maximum recommended safe starting dose，MRSD）。然而，能够高度激活免疫系统的生物药物，即使在低剂量下也可能会引起诸如细胞因子释放综合征、神经系统毒性等强烈的副作用。
在TGN1412，CD28超级激动剂临床实验Ⅰ期“惨案”过后，为了提高临床实验的安全性，EMA和FDA在2007年发布了针对生物药FIH确立的具体指导方针，其中强调了包括双特异性抗体在内的一系列药物的FIH计算，应该基于“最小预期生物效应级别”（minimum anticipated biological effect level，MABEL），此概念认为是在人体中可以被认为有生物学效果的最小剂量。
近日，来自杜克大学的学者在《Journal for Immunotherapy of Cancer》上发表的文章，详细分享了通过MABEL方法计算他们设计的一种用于治疗胶质母细胞瘤的EGFRvⅢ-CD3双特异性抗体（EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv）MRSD的方法，同时验证了通过此方法计算得出的FIH剂量在人外周血CD3的理论受体占有率（Theoretical receptor occupancy），来确定这一FIH剂量的安全性。
在本文中，MABEL的计算应用了体外、体内药代动力学/药效学（PK/PD）的数据，包括：在人类与相关物种体内靶细胞上的靶标结合及受体占有率；人类与相关物种靶细胞上的浓度-反应（concentration-response）曲线；相关物种体内的剂量/暴露-反应（dose/exposure-response）曲线等。
EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv与血细胞的结合
研究者使用了流式细胞法，分别检测了EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv双特异性抗体与人、比格犬、CD-1小鼠、食蟹猴、Sprague Dawley大鼠、新西兰白兔和猪的外周血单个核细胞（PBMC）的结合能力，来评估EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv在细胞水平上与CD3ε的亲和力。实验结果显示（图1），EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv只与人的PBMC结合，与其他种类动物的PBMC不结合。与人PBMC结合的EC20为150ng/mL。
图1 流式细胞法检测，在人及相关物种（食蟹猴、比格犬、小鼠、新西兰白兔、大鼠）的PBMC中，EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv 只与人的PBMC结合，且EC20为150ng/mL
EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv与肿瘤细胞的结合
使用流式细胞法，分别检测了EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv与野生型人胶质瘤细胞系U87-MG（不表达EGFRvⅢ）及U87-MG-EGFRvⅢ稳转肿瘤细胞系（表达EGFRvⅢ）的结合，用以评估EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv与EGFRvⅢ在细胞水平上的结合能力。结果如图2，EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv与U87-MG-EGFRvⅢ稳转肿瘤细胞系结合的EC20 为10307 ng/mL，与野生型U87-MG细胞系基本无结合。
图2流式细胞法检测，EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv与EGFRvⅢ高表达肿瘤细胞系结合的EC20 为10307 ng/mL
细胞因子释放实验
使用Luminex multiplex platform，分别在PBMC单独存在、PBMC+ U87-MG-EGFRvⅢ细胞（EGFRvⅢ+）、PBMC+ U87-MG细胞（EGFRvⅢ-）条件下，对hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介导的人PBMC细胞因子释放进行了检测，使用PMA作为阳性对照。结果显示（图3），hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介导人CD3+的细胞产生细胞因子的释放量具有肿瘤抗原依赖性和剂量依赖性，在无EGFRvⅢ抗原存在的情况下，EGFRvIII-CD3 bi-scFv无法诱导细胞因子释放；在有EGFRvⅢ存在的情况下，EGFRvIII-CD3 bi-scFv诱导人PBMC细胞因子IFN-ɣ、IL-6、MIP-1α、GM-CSF和TNFα释放的EC20分别为42.3、12.5、14.7、27.6和16.5 ng/mL。
图3 hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介导的人PBMC细胞因子释放呈抗原依赖效应及剂量依赖效应
T细胞激活和增殖实验
将EGFRvIII-CD3 bi-scFv在存在肿瘤抗原（U87-MG-EGFRvⅢ）或不存在肿瘤抗原（U87-MG）的条件下与人PBMC共同孵育5天，分别通过检测CD25+T细胞的表达量和CFSE标记细胞的比例来评估EGFRvIII-CD3 bi-scFv激活T细胞及诱导T细胞增殖的能力。结果显示，EGFRvIII-CD3 bi-scFv介导的T细胞激活及T细胞增殖具有抗原特异性和剂量依赖效应。在EGFRvⅢ存在的体系中，EGFRvIII-CD3 bi-scFv激活T细胞和介导T细胞增殖的EC20分别为1021ng/mL、70.2 ng/mL。
图4 EGFRvIII-CD3 bi-scFv在EGFRvIII+体系中介导T细胞激活的EC20为1021ng/mL为，介导T细胞增殖的EC20为70.2 ng/mL
肿瘤细胞杀伤实验
使用铬释放测定法，分别检测了EGFRvIII-CD3 bi-scFv对U87-MG-EGFRvⅢ细胞和U87细胞的杀伤效果，效靶比为20:1。结果显示，EGFRvIII-CD3 bi-scFv对U87-MG-EGFRvⅢ细胞的杀伤效果具有剂量依赖效应，EC20为1.34 ng/mL；对U87野生型细胞几乎无杀伤作用。
图5 EGFRvIII-CD3 bi-scFv对肿瘤细胞的杀伤效果具有肿瘤抗原特异性
以上全部体外实验结果汇总如表1所示，按照每种体外实验的20%药理活性浓度（20% of the maximal effective concentration，EC20），基于人平均血浆容积为3L、患者平均体重为70kg计算人体初始给药剂量（MRSD）。本系列实验中，最低的EC20来自于肿瘤细胞毒性实验（1.34 ng/mL），相当于每位患者4020 ng或 57.4 ng/kg的起始剂量。
表1 体外实验测定的EC20值及对应的HED值
小鼠体内重复给药、单次给药毒性实验
研究人员分别在NSG-人PBMC免疫重建小鼠模型和CD3人源化小鼠模型上进行了体内毒性实验。在移植了U87-MG-EGFRvⅢ胶质瘤细胞和人PBMC的NSG免疫缺陷小鼠中，EGFRvIII-CD3 bi-scFv的给药剂量为2.5 mg/kg，经尾静脉连续给药5天，每日一次。结果显示，给药组的小鼠生存率较溶剂对照组有显著性延长（图6，P=0.0079），证明EGFRvIII-CD3 bi-scFv在此模型上不具有毒性。
在CD3人源化小鼠模型中，研究人员也测试了EGFRvIII-CD3 bi-scFv单次给药10 mg/kg的剂量，同样未观察到显著的毒性反应（数据未给出）。此数据结合该实验室往次实验结果表明，在啮齿动物模型上，每日2.5 mg/kg的给药剂量为安全有效剂量。
图6 EGFRvIII-CD3 bi-scFv在U87-MG-EGFRvⅢ/PBMC-NSG鼠移植模型上可显著提高小鼠生存率
体内有效、安全剂量计算
基于啮齿类模型中每日2.5 mg/kg的安全有效给药剂量，计算人体等效剂量。公式为
CLhu：预期人体清除率；Ceff,ss：预测稳态下有效浓度；Tau：给药间隔
hEGFRvIII-CD3 bi-scFv的结构与博纳吐单抗（Blinatumomab，Blincyto，CD3-CD19双特异性抗体，2014年美国上市）类似，博纳吐单抗在成年人体内的清楚速率为43 mL/h/kg，因此研究者选用这个数据作为CLhu的参考。Ceff,ss为在hCD3转基因小鼠中以5 mg/kg剂量测得的PK数据（0.583 μg/mL）。给药间隔Tau为24小时。
根据此公式，计算出的人体等效剂量为0.6mg/kg，而由体外实验数据计算得出的MABEL剂量为57.4ng/kg，较啮齿类动物模型上药效数据计算出的剂量低10400倍。证实了此剂量（57.4ng/kg）在动物模型上的安全性。
受体占有率计算
靶抗原的理论占有率（receptor occupancy，RO）是药物临床起始剂量选择的重要因素之一。TGN1412 FIH的选择，0.1mg/kg的剂量换算得出的人体外周血中的RO约为90%，对于激动剂而言可能过高。在本文中，研究人员根据两个不同的公式评估了基于MABEL方法计算得出的hEGFRvIII-CD3 bi-scFv给药剂量（57.4ng/kg）在人体中的理论受体占有率，如下所示：
公式1：
公式1基于米氏方程（Michaelis-Menten equilibrium），其中RO为受体占有率，Ab为抗体起始浓度（引用细胞毒性实验EC20，1.34 ng/mL或26.3pM），KD为药物对应抗原的平衡解离常数。
公式2：
公式2为公式1的升级版，由于在已知体系中存在大量靶受体的情况下，由米氏方程计算出的RO可能不准确，因此选用公式2进行RO的计算。其中RO为受体占有率，KD为药物对应抗原的平衡解离常数，TD为总药物浓度（对应细胞毒性实验EC20，1.34 ng/mL或26.3pM），TT为总目标浓度。
TT的计算方法为：
其中n1为每个细胞上CD3受体的数目（6.11×104），n2为每体积中T细胞的数目（1.3×109 L−1），NA为阿伏伽德罗常数。
由公式2计算得出的MABEL剂量的理论受体占有率（引用与CD3ε结合的KD和细胞毒性实验的EC20）为0.17%。对于激动剂而言，根据已知药理学和临床前实验的经验，可接受的RO数据上限约为10%，本研究中基于MABEL剂量计算得出的RO的数据远低于这一限度。但研究人员也说明了这种方法的限制性，由于hEGFRvIII-CD3 bi-scFv为双特异性抗体，该方法无法计算药物同时与表达于不同细胞上的靶抗原（EGFRvIII于肿瘤细胞，CD3于T细胞）结合的理论受体占有率。
本文详细地介绍了一种激动剂型双特异性抗体基于MABEL方法计算FIH的过程及实验思路，通过对比MABEL剂量与临床前体内等效剂量，确定了这种方法的安全性，对于激动型抗体药物的FIH计算具有一定的参考价值。
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参考文献
Schaller, Teilo H., et al. "First in human dose calculation of a single-chain bispecific antibody targeting glioma using the MABEL approach." Journal for Immunotherapy of Cancer 8.1 (2020).
