近期“生物世界”的一篇原创文章，介绍了Cell在今年2月15日发布的“Inhibitory CD161 receptor identified in glioma-infiltrating T cells by single-cell analysis”（图1）。这篇论文的高光之处在于，单细胞在组织内成像的技术，实现了单细胞级别的蛋白表达检测。并且，文中提出了类似于免疫治疗的思路，将CD161视为潜在的治疗靶点，阻断CD161以激活细胞毒性T细胞（图2）。 图1 Cell最近发布的关于CD161的文章。高光之一：高技术，单细胞级别检测CD161在T细胞的表达，这些T细胞渗透进入了神经胶质瘤组织。 图2 高光之二：证明机制，具有细胞毒性的T细胞，也表达多种NK细胞受体。其中NK细胞表达的抑制型受体CD161，在T细胞也有表达，通过结合免疫调节细胞表达的CLEC2D，体现抑制活性。通过阻断CD161与CLEC2D的结合，可以激活T细胞的活性。
一、给你一张过去的CD CD161，别名NKRP1A（NK受体P1A）、KLRB1、CLEC5D，以下均称为CD161。其中，KLRB1（killer cell lectin-like receptor subfamily B1）是推荐的名称，中文翻译为“杀伤细胞的类凝集素受体亚家族B成员1号”。CD161目前只发现一种序列，没有其他变体。 LLT1，别名CLEC2D（前言的Cell所称），以下均称为LLT1，作为CD161的配体。LLT1（lectin-like transcript 1）为CLEC2D的1号变体，中文翻译“类凝集素转录体1”。这意味着CLEC2D存在多个变体，其中只有变体1，即LLT1，具有结合CD161的能力，且能够激活下游信号。其他变体，比如变体2、4，不结合CD161。 CLEC，C-type lectin domain family，可见CD161和LLT1同属于这个大家族，分属不同的亚家族。 CD161和LLT1的表达 CD161主要表达于粒细胞，以及单个核细胞的表面（图3A），表达特异性较好。单个核细胞，包括NK细胞和T细胞，其中T细胞包括Th17、NK T、记忆T细胞，但不包括原始T细胞（图3B）。另外，IL-17的表达与CD161的表达有极大的相关性，比如CD4+ TCRαβ+、CD8+ TCRαβ+、CD4-CD8- TCRαβ+、CD4-CD8-TCRγδ+等产生IL-17的细胞，它们存在CD161表达。另外，CD161+的细胞，IL-23R和RORC的表达量显著高于CD161-的细胞。 LLT1主要表达在小肠的派尔淋巴结，以及粒细胞、淋巴细胞（包括B细胞、T细胞、NK细胞）、扁桃体、肺、肾上腺、肾等部位（图3C）。外周循环的B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞，在静息状态下，不表达LLT1，但是激活后，比如TLR（toll-like receptor）激活的类浆细胞、单核细胞衍生的树突状细胞、激活的B细胞，都一定程度地表达LLT1，对NK细胞有抑制作用，但对T细胞具有激活作用。 图3A，CD161在粒细胞和单个核细胞中高表达，主要在淋巴组织表达，摘自bgee.org。 图3B，CD161的表达情况，分别在患者的上皮组织内淋巴细胞（灰）、肝淋巴细胞（白）、外周血淋巴细胞，分别是大约75%、60%、20%。其中，上皮组织内的CD3+CD161+阳性的天然T细胞，显著高于CD3-CD161+的NK细胞。 图3B，LLT1在小肠的派尔淋巴结高表达，主要在淋巴节和粒细胞表达，摘自bgee.org。 CD161和LLT1的信号通路 CD161在NK细胞上，作为抑制型受体，通过与其配体LLT1（CLEC2D）的结合，抑制NK细胞的细胞毒性，抑制IFN-γ的释放（图4A）。也有研究表明，在T细胞上，尤其是Th17上，CD161可作为其细胞亚群标记，为激活型受体，激活Th17表达和分泌IL-17（图4B）。也可以通过TCR信号通路激活T细胞，促进IFN-γ的释放。 图4A，NK细胞机制。LLT1表达在特殊的肿瘤组织中，比如三阴性乳腺癌（TNBC）、前列腺癌、B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞。表达于肿瘤细胞表面的LLT1，与NK细胞表达的CD161结合，给出抑制信号，降低其细胞毒性。LLT1在部分肿瘤组织中高表达，以抑制NK细胞的杀伤。 图4B，T细胞机制。神经磷脂酶（ASM），调节CD39和CD161的细胞内信号，并促使Th17的增殖。在Th17分化条件下，CD4+ T细胞内，MHC/CD3/CD28，以及IL-6的刺激信号，激活mTOR和STAT3信号。同时，CD39和CD161的刺激信号进一步增强了上述信号，最终导致Th17增殖，以及分泌IL-17。 CD161的胞内区并没有NK细胞受体常见结构域的ITIM，即“免疫受体中基于酪氨酸的抑制型模体”，或ITAM，激活性模体。因此，CD161激活后的下游信号，不同于常见的NK细胞受体激活模式，并且在NK、T细胞中可能产生了不同的结果：一方面，胞内域通过与CD39的结合，激活神经磷脂酶（ASM、SMPD1），通过STAT3、mTOR等通路，上调细胞内神经酰胺的表达；另一方面，激活AKT1/PKB和RPS6KA1/RSK1激酶和下游信号，这与通过CD3激活T细胞的通路一致。 研究表明，CD161的表达，受IL-12调控，依赖于IL-12作用时间和剂量。IL-12可提高NK细胞表面的CD161，进而抑制NK细胞活性，这是一个负反馈的过程。另一方面，IFN-β可导致CD161表达降低。 CD161和LLT1的结构和修饰 CD161是一种二型的穿膜糖蛋白，存在3对链内二硫键，以及1个N糖基化位点（图5）。 LLT1也是一种二型的穿膜糖蛋白，存在2对链内二硫键，以及2个N糖基化位点（图5）。 二型的穿膜蛋白，即N端为胞内域，C端为胞外域。 
 
图5 CD161的结构信息，摘自Uniprot.org。CD161全长为225个氨基酸，保外域为67~225，其中含有3对链内二硫键，并存在1个N糖基化位点。 
 
图6 LLT1的结构信息，摘自Uniprot.org。LLT1全长为191个氨基酸，保外域为103~184，其中含有2对链内二硫键，并存在2个N糖基化位点。 考虑到如果我们筛选一种阻断CD161-LLT1结合的抗体，N糖基化如果影响了表位的构象，那么抗体的结合也会受到N糖基化的影响。如果付诸于行动，这个修饰的问题是无法绕开的。
二、迷失自我的狂欢 从CD161在NK细胞上的调控模式看，存在顺式作用（NK细胞能在某种刺激条件下，同时表达CD161和LLT1，抑制自身活性）、反式作用（B细胞、T细胞、树突状细胞表达LLT1，从而抑制NK细胞）。阻断CD161-LLT1的结合，可以增强NK细胞的细胞毒性，释放IFN-γ。 另一方面，CD161+CD8+的T细胞，被分类为组织追踪MAIT（粘膜相关不变T细胞），细胞毒性Tc17细胞，或者记忆T细胞，具有组织追踪和增强的细胞毒性。记忆细胞可以对病毒感染、细菌感染、抗原呈递细胞的刺激做出响应，进而上调细胞因子，比如INF-γ、IL-17，释放颗粒酶。 利用NK细胞的免疫检查点机制，对NK细胞的抑制解除，以及激活，是一种新的免疫治疗的前沿。我在之前的文章（https://mp.weixin.qq.com/s/5bWB41CAyKXi0348XTtIHw），总结了NK细胞作为免疫治疗的新方向，列举了一些NK细胞的激活或抑制型受体。比如激活型的KIR2DS、NKp80、NKp46/44/30、NKG2C/D/E、DNAM-1、CD16a，抑制型的KIR3DL、NKG2A/CD94、CD161/LLT1、PD-1、TIGIT、CD96、LAG3等（图7、8）。 图7 NK细胞表面的抑制型受体（红）和激活型受体（绿）。ITIM，immuno-receptor tyrosine-based inhibitory motifs，免疫受体中基于酪氨酸的抑制型模体；ITAM，immuno-receptor tyrosine-based activation motifs，免疫受体中基于酪氨酸的激活型模体。KIR，killer Ig-like receptor，杀手细胞类免疫球蛋白受体。 图8 NK细胞受体的分类。在NK细胞上，顺式结合的CD161和LLT1，与MHC-I结合，抑制其活性。 NK细胞，占PBMC的5~10%，与CD8+ T细胞，有类似的杀伤活性（cytotoxicity），但是细胞的标记物与CD8+ T细胞有显著差异，不表达CD3和TCR。NK细胞的抗原特征为CD56+CD3-，其中85%~95%的NK细胞为CD56dim（暗）CD16ahigh，主要是成熟的杀伤细胞，高表达KIR，可分泌穿孔素和颗粒酶，剩余的为CD56bright（亮）CD16alow，有未成熟的NK细胞，低表达KIR和NKG2A/CD94。NK细胞的分类中，还包括抗原呈递NK（APNK）、辅助NK（NKh）、调节NK（NKreg）。 与T细胞需要抗原呈递的过程不同，细胞毒性NK细胞是天然免疫系统的一部分，不需要抗原呈递，组织相容性复合体（MHC）I类复合体与NK细胞结合，通常激活抑制型的受体（含ITIM，图7），抑制了NK细胞的活性，这也是组织细胞避免被NK细胞杀伤的机制。在一部分肿瘤组织中，肿瘤细胞虽然下调了MHC-I的表达，规避了T细胞的识别，但因为MHC下调激活了NK细胞的活性，补充了T细胞的不足。 NK细胞的杀伤机制，称为“missing self”，即“迷失自我”。也有研究表明，MHC-I可激活NK细胞（图8）。因此，NK细胞的杀伤活性，基于抑制和激活信号的平衡。 因此，如果不考虑肿瘤内环境的恶劣、肿瘤细胞对NK细胞的塑造、调节型细胞的抑制的话，类比NKG2A/CD94，我们也可以将CD161/LLT1加入到这一场NK细胞“迷失自我的狂欢”中。目前，关于NK细胞的抗体（BiKE、TriKE），或者CAR-NK的临床实验，也在如火如荼进行中，也可以给我们一些借鉴。 然而，我们不能过于乐观地估计NK细胞的杀伤，除了血液淋巴瘤，还有肿瘤微环境的巨大挑战： 1. 抑制信号，包括抑制型受体介导的（图7、8），以及抑制型细胞因子，比如TGFβ、IL-10； 2. 抑制细胞，Treg、NKreg、骨髓瘤衍生抑制型细胞（MDSC）、基质细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞；比如，Treg细胞、MDSC细胞表达TGFβ，结合NK细胞的TGFR2，从而下调其表面的NKG2D、NKp30这些激活型受体，使其被激活的能力降低； 3. 浸润能力，在非小细胞肺癌（NSCLC）中，未检测到NK细胞亚群，但是存在CD161+CD4+、CD161+CD8+的T细胞。在结直肠癌中，几乎完全排除NK细胞的浸润； 4. 肿瘤微环境中，缺氧、低糖，颗粒酶B的半衰期显著降低。 我们可以通过IL-12、IL-15、IL-18，是NK细胞聚集在肿瘤组织并维持活性。然而，IL-12促进CD161的表达，进而抑制NK细胞的活性。IL-15具有促进NK细胞增殖和杀伤活性的能力，但是单独使用，并不能维持NK细胞的渗透能力。
三、小结 本期推送，我们给大家介绍了CD161和LLT1，并且讲述了CD161在NK细胞上的调控模式以及肿瘤微环境的巨大挑战。下一期中，我们会接着带来CD161成药性的挑战以及CD161在T细胞尤其是CD8+的T细胞的病理机制。 |
