技术分享 | 基于IgG1的双特异性抗体的设计、表达和纯化 |
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2020-06-15 |
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来源：生物制品圈
摘要：双特异性抗体（BisAbs）由于具有两个不同的抗原结合位点，可以同时靶向两种受体从而为癌症和炎症等复杂疾病提供可能的治疗方法，目前已经成为极具研发前景的新型药物候选物。本文基于全长IgG-scFv形式的BisAbs，提供了下图所示临床前研究包含的从分子设计，重组表达到下游纯化的方法概述，并讨论了优化瞬时表达和纯化需要实际考虑的因素和策略。
1. 双特异性抗体概述
BisAbs由两个不同抗原结合位点组成一个抗体分子，与结合单个靶标的抗体相比，BisAbs具有几个优点：
(1) 通过两个靶标结合在不同细胞上，BisAbs可以将特定的免疫细胞（如T细胞和NK细胞）重定向到肿瘤细胞，以增强肿瘤杀伤力；
(2) BisAbs可以同时阻断两种不同介质在癌症和炎症等复杂疾病的进展中的作用；
(3) BisAbs由于与两个不同的细胞表面靶标相互作用而增加了结合特异性；
(4) BisAbs促进受体聚集，从而促进靶标内化和降解。
过去二十年中，分子工程学的进步导致了一系列具有不同结构和分子量的重组BisAb的开发，目前已经有两种基于IgG的BisAb（catumaxomab和emicizumab-kxwh）和一种片段BisAb（blinatumomab）获批上市，以及处于不同临床阶段的50多种候选药物。BisAb可以分为两类，即具有和不具有抗体Fc区的BisAb，前者即IgG样BisAb由于具有Fc区，因此有助于其纯化，溶解性和稳定性，并提供额外功能，例如抗体依赖的细胞毒性，补体依赖的细胞毒性，FcRn介导的延长半衰期以及药物结合框架。本文所述BisAbs基于全长IgG1抗体支架和单链可变区（scFv）。
1.1 IgG1的结构特征
如Fig. 2所示，IgG1分子由四个多肽链，即两个相同的重链（HC）和两个相同的轻链（LC）组成。HC由一个可变域（VH）和三个恒定域（CH1，CH2和CH3）组成。每个LC包含一个可变域（VL）和一个恒定域（CL）。VH和VL 域各自具有三个互补决定高变区定义抗体的特异性。VH-CH1结构域与VL-CL 结构域相互作用形成抗原结合片段（Fab），每个IgG1分子都包含两个抗原结合位点，其Fc结构域提供效应子功能并延长了半衰期。
1.2 ScFv的结构特征
在IgG1的模块化抗体片段中，scFv是产生功能性单价抗原结合片段的最常用的方式。ScFv由抗体的VH和VL 结构域组成，其中第一个可变域的C末端通过柔性肽linker与第二个结构域的N末端连接（Fig. 3A），包括VL-linker-VH或VH-linker-VL两种连接方式（Fig. 3B）。由于两个可变域的分子间配对混杂，并且VH和VL 结构域之间非共价相互作用的亲和力和特异性相对较低，所以scFv重组生产可能会导致单体，二聚体和高阶多聚体混合物的出现。这些寡聚混合物的形成受linker的长度和组成的影响，Fig. 3B所示linker中，(GGGGS)3使最广泛，但是(GGGGS)4可以最小化上述聚集体的形成。此外，将VH 44和VL 100位点突变为半胱氨酸以形成两个域之间的链间二硫键，也是减少寡聚和提高scFv稳定性的一种广泛使用的策略（Fig. 3 C，D）。
2. IgG1-scFv BisAbs的设计
本文描述的IgG1-scFv BisAbs如Fig. 2中所示，Fig. 4显示了用于工程化IgG1-scFv的设计示意图，具体设计策略如下：
2.1 ScFv设计策略
所有scFv均选择VL-VH方向，用(GGGGS)4 linker将VL与VH连接，并将VH 44和VL 100位点突变为半胱氨酸形成链间二硫键，以减少寡聚并提高scFv稳定性（Fig. 3）。
2.2 IgG1与scFv的连接策略
提供Fig. 2所示的4种可行性连接策略，具体方案如Fig. 3所示。
在Bis1Ab中，scFv使用(GGGGS)2 linker连接到LC的N端，原始HC维持不变；在Bis2Ab中，scFv使用(GGGGS)2 linker连接到HC的N端，原始LC维持不变；在Bis3Ab中，scFv 使用(GGGGS)2 linker连接到CH3域的C末端，原始LC维持不变；在Bis4Ab中，scFv使用(GGGGS)2 linker插入到位置220后的铰链域，以连接scFv的N端和C端，原始LC维持不变，轻链和重链之间以及铰链之间的天然链间二硫键维持不变。
上述几种BisAbs已用于多种治疗环境。例如，基于Bis2Ab的MEDI4276（由MedImmune开发，I期临床）作为成人晚期乳腺癌或胃癌的二线治疗药物；基于Bis3Ab的MM-141（由Merrimack开发，II期临床失败）用于治疗转移性胰腺癌；基于Bis4Ab的MEDI3902（由MedImmune开发, II期临床）用于预防接受重症监护的成年患者出现的呼吸机相关性肺炎。
3. IgG1-scFv BisAbs的重组表达
3.1 表达载体的设计
这里描述的BisAb与IgG1类似,都是由等摩尔比的多肽链组成的异二聚体。重组表达是通过编码两个多肽链的单个载体系统实现的，每个多肽链都有自己的基因表达盒。使用单载体系统的优点包括：
(1) 仅使用一种载体进行转染更加简便；
(2) 基于基因表达盒的系统促进高通量克隆；
(3) LC和HC的基因比例相等，在平衡BisAbs表达的同时最大程度地减少LC产生过量。
BisAb重组表达载体示意图如Fig. 5所示。具体的，两条BisAb链的表达是由单独的巨细胞病毒启动子（PCMV）驱动，BisAb链的有效分泌受两个单独的信号肽控制，该信号肽介导两个多肽向内质网的转运，以进行适当的折叠，组装和翻译后修饰。LC多肽信号序列是MDMRVPAQLLGLLLLWLPGPGARC，其是天然人κLC信号肽，HC多肽信号序列是MGWSCIILFLVATATGVHS，其对应于小鼠HC前导序列。载体中包含SV40 多聚核苷酸序列，且存在的独特限制酶切位点可促进抗体可变区的克隆。
3.2 优化DNA密码子实现最佳哺乳动物表达
用于BisAb抗体骨架的可变域VH和VL以及scFv的序列可以源自公共数据库，杂交瘤，噬菌体展示，酵母展示和哺乳动物展示。这些DNA序列通常不是最佳的用于在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞最大化重组蛋白质表达。
密码子会影响基因表达，稳定性和翻译效率。DNA序列优化包括去除核苷酸重复序列，内部TATA盒，核糖体进入位点以及剪接供体和受体位点；减少富含AT或GC序列延伸；优化tRNA密码子的使用频率，以最大化信使RNA的翻译和稳定性。除了VH，VL以及scFv之外，BisAb的linker序列和恒定域也可以进行密码子优化。另一个基因设计策略是通过密码子优化过程来减少LC的表达（因为LC通常比HC过表达）。
3.3 DNA载体制备
使用无内毒素质粒DNA纯化方法制备BisAb表达载体（例如来自Qiagen的EndoFree质粒试剂盒（#12362））。内毒素是从细菌中提取的质粒DNA中的常见污染物。因此，在生产用于体外和体内研究的BisAb时，必须使用无内毒素的材料和试剂。可以按照手册使用Charles River Endosafe PTS系统（#PTS100）确定内毒素的存在，小于0.1 EU/mg的质粒DNA被认为不含内毒素。DNA载体制备好后可储存于-80℃备用。
3.4 制备用于瞬时表达的哺乳动物细胞
制备DNA载体后，通过CHO悬浮细胞进行瞬时表达。使用添加有25μM蛋氨酸亚砜亚胺（MSX）和100μg/ mL潮霉素-B（HB）的MedImmune专用培养基培养和维持细胞。在2升一次性聚碳酸酯锥形培养瓶（VWR, #FPC2000S）使细胞以500 mL的体积生长，将瓶置于37℃，140rpm， 5%CO2环境下的Multitron培养箱（InforsHT）中培养。每3天分裂一次细胞，以确保存活率保持在97%以上，并且细胞密度不超过5×106 / mL。
3.5 瞬时转染表达
在转染过程中加入HB和MSX将对细胞活力有害，因此我们将细胞以0.5×106 /mL的浓度在不含HB和MSX的MedImmune培养基中传代培养 3天，以稀释CHO悬浮培养时引入的HB和MSX。
转染前：转染前24h，用MedImmune培养基将细胞稀释至1×106 /mL，以在转染时获得浓度约为2×106 /mL的细胞。
转染中：对于500 mL转染，我们向7.5 mL 150 mM无菌氯化钠溶液中添加了500μg无内毒素的DNA。在另一个无菌试管中，我们向5 mL 150 mM无菌氯化钠中加入2.5 mL 1 mg/mL聚乙烯亚胺（PEI, #24756-1）。然后将DNA和PEI溶液合并，并在室温下孵育1 min，随后将DNA/PEI混合物添加到细胞中，并持续至少4 h的培养过程。此后，向转染细胞中加入3.3%（v/v）的MedImmune原料A和0.2%（v/v）的MedImmune原料B，并转移至34°C的培养箱进行瞬时表达。
转染后：在转染后3，7，10和14天确定细胞活力和表达水平，瞬时表达在转染后14天或当细胞活力降至70%以下时终止。
3.6 细胞活力的测定
使用Visell XR细胞活力分析仪（Beckman Coulter）测定细胞活力和密度。该系统设置为使用一次抽吸循环混合3次，并收集30张最小直径为5μm，最大直径为10μm的图像。亮度设置为85%，清晰度设置为100，活细胞斑点亮度设置为65%，活细胞斑点面积设置为5%，减聚度为中等。这些设置对于我们在瞬时表达方案中使用的CHO细胞是最佳的。
3.7 瞬时表达后的CHO收获
转染后十四天或当细胞活力降至70%以下时，使用Beckman Coulter Allegra X 15R台式离心机在室温下离心（1000 g） 20 min收集CHO细胞。丢弃细胞并通过0.22 µm真空过滤装置（VWR，#97066-204）过滤培养基。过滤后的培养基可以在4°C或-80°C下存储，解冻后建议重新过滤存储的培养基。
3.8 BisAb的定量
使用下述方法来量化细胞培养期间以及收获和过滤后得到的BisAb。该定量方法基于将BisAb结合至与Agilent 1200高效液相色谱（HLPC）连接的蛋白A柱（POROS A，20μM，4.6×100 mm，1.7 mL，Thermo Fisher Scientific#2502226 ）上。
BisAb检测：通过0.2μm离心过滤器（VWR，#82031-356）过滤培养基（150 µL）。然后将过滤的培养基（100 µL）注入HPLC蛋白A系统，并执行以下步骤：100%流动相 A（0.5min），100%流动相 B（1.5 min），100%流动相A（2 min）。在室温下以3.5mL/min进行色谱操作，并于280 nm吸光度下检测BisAb。其中，结合流动相A为1×PBS，pH 7.2（Thermo Fisher Scientific，#20012-027），洗脱流动相B为含有0.1％磷酸（v/v）的1x PBS pH 1.8。
标准曲线制作：按照上述相同的方法制作标准曲线（Fig. 6A）。使用15.6至2000μg（15.6，31.25，62.5，125，500，1000和2000μg）范围的99%单体IgG1制作标准曲线，并绘制样品浓度与每种洗脱标准品在280 nm处洗脱曲线（Fig.6 B）下面积的关系，然后通过将曲线下的面积乘以标准曲线的斜率的倒数来计算BisAb的浓度。Fig.7为转染10天后4种特异性BisAb的瞬时表达数据（于第14天终止）。
4. IgG1-scFv BisAbs的纯化和评估
4.1 从培养基中纯化BisAb
BisAb的纯化使用蛋白A 亲和色谱法进行，该方法通常用于纯化具有完整Fc区的IgG1和BisAb。此处提供的方法使用500 mL培养基和1个5 mL MabSelect Agarose Fast Flow（GE Health Life Sciences, #28-4082-55，载量为30 mg/mL），可以根据起始培养液的体积和预期规模进行适当缩小或放大。
准备工作与介质平衡：将色谱柱连接到AKTA Pure系统（GE Health Life Sciences），在室温下于5mL/min流速，280nm波长监控下进行纯化。首先用10倍柱体积（CV）的无菌水处理该柱，以去除20%乙醇存储溶液，然后用10 CV无内毒素的1x PBS，pH 7.4（结合缓冲液）平衡介质。
BisAb吸附：将过滤后的澄清上清液加载到色谱柱，然后用结合缓冲液冲洗10 CV以洗去未结合的杂质污染物，各组分收集后保存在4°C以便进行后续分析（如果需要）。
BisAb洗脱：使用0.1 M甘氨酸-HCl，pH 2.2 洗脱亲和捕获的BisAb。在预装有50μL 1.0 M Tris-HCl，pH 7.0且不含内毒素的1.5 mL Eppendorf管中收集500μL洗脱组分。洗脱组分可在4°C下最多保存3天，然而这种储存有可能导致抗体聚集。
抗体聚集是低pH条件下从蛋白A色谱中洗脱BisAb经常遇到的挑战。为了使聚集最小化并提高产量，我们经常采用洗脱优化方法，例如使用3.2的pH值，并向洗脱缓冲液中添加0.1 M的精氨酸，这已被证明可以防止抗体聚集。洗脱后进行色谱柱再生，即将蛋白A柱用5 CV的0.1 M甘氨酸-HCl（pH 2.2），10 CV的结合缓冲液，10 CV的超纯水和10 CV的20%（v/v）乙醇洗涤。
4.2 BisAb浓度测定
使用Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000分光光度计在280 nm处测定吸光度，再根据理论消光系数确定上述洗脱组分中的BisAb浓度。
4.3 BisAb单体含量测定
通过尺寸排阻高效色谱分析（SEC-HPLC）测定上述洗脱组分中的BisAb单体含量。使用配备自动进样器，高压梯度溶剂输送泵，色谱柱室和二极管阵列检测器（在280 nm波长检测）的Agilent 1260系列HPLC系统，以及Tosoh Bioscience的TSKgel G3000SWxl SEC色谱柱（300×7.8 mm，250Å，粒径5 µm）。
室温下的运行条件包括流速1 mL/min；运行时间20min；流动相100 mM磷酸钠和100 mM硫酸钠，pH 6.8。每次分析使用100μg BisAb。蛋白质A纯化和陶瓷羟基磷灰石层析（CHT）纯化（用于去除聚集体）后BisAb的典型SEC-HPLC色谱图如Fig. 8 A, C所示。由于疏水性增加，某些BisAb可能在SEC凝胶基质上发生非特异性吸附，从而导致保留时间偏移和较差的峰分辨率。我们发现向流动相中添加10%异丙醇（v/v）（Sigma Aldrich，#I95516）可以减少非特异性吸附，从而提高色谱分辨率。
4.4 去除聚集体和其他杂质
CHT被广泛用于从聚集体和其他蛋白A纯化后的杂质中纯化单体抗体和BisAb 。抗体或BisAb与CHT树脂之间存在多种相互作用方式，主要方式是抗体或BisAb表面胺与CHT树脂磷酸基团之间的阳离子交换，以及CHT树脂钙位点于抗体或BisAb羧基之间的金属螯合。
准备工作：我们使用预装的II型CHT树脂（BioRad，E732-4334；载量为15–25 mg/mL）和磷酸盐缓冲液的线性梯度溶液作为流动相进行洗脱。使用AKTA Pure系统（GE Health Sciences）在室温下以5 mL/min和280 nm的吸光度进行纯化。流动相A为pH 7.0的10 mM磷酸钠，流动相B为pH 7.0的含2 M NaCl的10 mM磷酸钠。
纯化过程：将上述蛋白A色谱洗脱下的BisAb上样到预先平衡过的CHT柱上，然后用5 CV流动相A洗去杂质。然后通过在25 CV内线性梯度切换至100%流动相B对BisAb进行洗脱。BisAb的典型CHT色谱图如Fig.8B所示，包括聚集体在内的杂质在单体之前被洗脱。收集每个主峰的1 mL馏分，然后使用SEC-HPLC分析其单体含量。可以看到，使用CHT纯化后BisAb单体含量为97%（Fig. 8C），在CHT之前该数值为70%（Fig.8 A）。随后按照手册对CHT色谱柱进行再生，并保存在0.1 N NaOH中。
4.5 制剂
CHT后，将合并的单体BisAb馏分使用0.22-μm注射器过滤器（VWR，#28144-040）进行过滤，并在25 mM组氨酸-HCl，7%蔗糖，pH 6.0中于4°C下透析过夜。透析后将BisAbs用0.22-μm注射器式过滤器重新过滤，然后使用Mustang E注射器式过滤器（VWR，#28140-521）过滤，以去除潜在的内毒素污染。加入聚山梨酯-80至终浓度为0.02%（v/v）。确认单体含量，并且制备等分的BisAb，如果其单体含量>97%，则将其保存在-80°C中。
5. 结论
BisAb在癌症免疫治疗中具有广泛的应用潜力，它们可以以更加特异性的方式重定向效应细胞，改善组织选择性并将细胞毒性有效载荷递送至靶点。本文全面描述了BisAbs的设计，表达以及纯化的方法。
由于本文的BisAbs中存在Fc区，因此此处的设计，表达和纯化方法可以推广应用到IgG样BisAb的工艺开发中。但是，BisAb开发中的一些挑战仍然需要改进，例如优化纯化过程和回收率以确保稳健，稳定和可放大的BisAb生产工艺过程等。本文提供的方法用于在临床前研究中使用CHO细胞制备大量BisAb（7周内即可完成）。所需试剂和材料大部分在市场可以买到，但表达载体，细胞培养基和细胞培养原料来自MedImmune，因此当使用可商购的抗体表达载体和培养基时，可以对策略和方法进行适当调整和优化。
如涉及知识产权请与我司联系
参考来源：
Dimasi N, Fleming R, Wu H, et al. Molecular engineering strategies and methods for the expression and purification of IgG1-based bispecific bivalent antibodies[J]. Methods, 2019: 77-86.
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