来源:Lucas  CancerEvolution        发布时间：2019-7-6

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背景

著名进化生物学家Stephen Jay Gould在21世纪初曾提出一个问题，如果我们能够把生命像磁带一样倒转到最开始的起点，再次进化，我们是否还会得到相同的结果[1]? 尽管逆转生命目前仍是一个猜想，但是癌症的发生发展正像磁带一样每天进行播放或者重复播放，仅2012年在全球就有1400万新发病例和820万人患癌死亡，且这个数目预计在接下来的二十年内将会增长70%[2]。癌症之所以有如此高致死率和低治愈率及其普遍存在的抗药性，主要问题在于癌症的异质性。癌症进化过程中复杂多变的遗传和表观修饰突变给其进化发展方向带来多种可能性，同时也正是由于这些突变资源，随着高通量测序技术的发展，我们可以通过测序来获取这些突变信息，来解码癌症的进化磁带，推断这些基因组变异在进化磁带上的发生顺序，挖掘癌症进化过程中的关键事件，从而给癌症的延缓甚至治愈提供方向。

纵观目前已进行多区域测序的癌症研究项目，不同癌症类型的不同病人在肿瘤转移或复发时出现的亚克隆编码突变数目在0～8000范围内高度变化（图1）[3]。尽管在取样过程中、癌症分级、测序深度方面存在差异，但是可以明显地看到在一些特定的癌症类型中，如黑色素瘤、肺癌，主克隆突变数显著高于其他癌症类型，这可能是由于此类癌症发生发展容易受到外界环境因素如紫外线照射和尼古丁类致癌物的影响（图1）。同时高丰度的主克隆突变并不意味着高丰度的亚克隆突变，如初级神经脑胶质瘤拥有最高丰度亚克隆突变，但是其主克隆突变数却较低，表明癌症进化过程中存在多样的突变机制，对于这类肿瘤，高丰度亚克隆突变可能是跟错配修复缺陷有关[4-5]，而在非小细胞肺癌和膀胱癌中却可能是由于APOBEC家族导致[6-8]。所以，在一些特定肿瘤里，主克隆突变反应了在肿瘤发生前的进化情况，亚克隆突变则更多地是癌症发生后的进化情况，在肿瘤治疗过程中，我们应该综合考虑两者情况。

图1 不同癌症类型非沉默突变的异质性程度分布

癌症进化过程中关键突变发生的不同顺序有时会导致截然不同的癌症发展方向。在骨髓增殖类肿瘤中，先发生TET2突变将会导致造血干细胞等祖细胞扩张，而红系祖细胞的增值会受到抑制直到出现JAK2突变；相反，若是JAK2突变发生在前，红系祖细胞将会出现增值扩张而造血干细胞则会受到抑制。在临床层面，JAK2突变在前的病人往往相比于先发生TET2突变的病人更可能出现红细胞增多症也更可能造成血栓（图2）。对于两者不同进化模式的治疗方法也会有不同的侧重点，因为针对早期的突变进行靶向治疗，在一定程度上影响的是所有的癌症细胞，所以ruxolitinib作为JAK2抑制剂在JAK2早期突变病人身上则会相对取得最佳治疗效果[9]。

图2 JAK2和TET不同突变顺序对骨髓增殖类肿瘤的影响

 目前，大约有16种癌症类型通过多区域取样测序构建了对应的突变顺序进化图(表1)。以肾癌进化为例，往往是最早期发生了3p的杂合丢失和VHL突变，随后同样在3p的位置上再次出现了SETD2，BAP1等基因突变。癌症进化过程中除了编码突变还会存在甲基化修饰，拷贝数变化，结构变异等一系列突变，这些突变有时出现在癌症进化的不同阶段分别扮演不同的角色，同时这些突变之间也会存在协同或是相互影响，比如在非小细胞肺癌中，早期染色体不稳定性会在一定程度上影响后期突变的异质性程度，也会显著提高癌症复发死亡的风险[10]。

表1 16种癌症类型的早期和晚期克隆突变

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研究手段

1. 抗药性或着复发的肿瘤患者。药物治疗前后，复发前后，至少2次取样。

2. 多个转移灶的肿瘤患者。对于多个转移区域进行取样。

3. 接受免疫药物治疗的肿瘤患者。免疫应答与不应答患者分组。

4. 以上均进行WES 测序，视前期结果和研究目的而定是否进行RNA测序，ctDNA，TCR 测序，CRISPR-Cas9 细胞系实验验证。

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研究方法

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研究案例

1. 白血病复发前后取样揭示白血病进化历史和关键突变(【文章解读】时间维度多点取样揭示肿瘤进化复发的关键突变, Catherine J Wu et al, 2015, Nature)[11].

   

   多点时间维度的取样测序可以揭示肿瘤的进化历史，研究不同治疗手段下抗药性的根源，启发下一步的治疗靶标。

2. 多区域测序揭示非小细胞肺癌进化历史(克隆进化分析-多区域测序, Charles Swanton et al, 2017, NEJM)[10]

多区域取样测序同样也可以研究肿瘤的异质性和进化历史，定位主克隆和亚克隆突变，在临床治疗和药物开发方面更有针对性。 

3.ctDNA监控非小细胞肺癌克隆结构动态变化(【文章解读】系统的ctDNA分析揭示早期肺癌的进化, Charles Swanton et al, 2017, Nature)[12]

通过ctDNA的方法对已构建的肿瘤进化结构进行监控，对药物治疗和手术治疗的疗效进行评估，对肿瘤的抗药性和复发进行预测。

挖掘能够引起肿瘤免疫活性的抗原突变，尤其是相关的主克隆突变抗原，这将给接下来的免疫治疗提供精准的方向。

5.解密免疫微环境异质性(文章解读 | 肿瘤不同转移时期的免疫微环境异质性研究, Martin L. Miller et al, 2017, Cell)[14]

肿瘤免疫是一个肿瘤细胞和微环境相互作用的复杂过程，微环境也会存在免疫异质性，揭露它们之间的相互关系，在免疫细胞层面发掘出能够引起特定T细胞抗原受体扩张的突变抗原，能够进一步佐证突变靶标的正确性，给肿瘤免疫药物的开发，如肿瘤免疫疫苗，小分子化合物，T细胞的体外改造和回输，提供精准的方向和理论指导。

6.研究肿瘤免疫逃逸和免疫不应答机制(文章解读 | Science新文揭示影响肿瘤免疫疗法应答的关键因素, Van Allen et al, 2018 & Shirley Liu et al, 2018 Science）[15-16]

免疫应答与不应答患者分组，常规基因组分析得到差异基因组变化，分析转录组数据，验证是否影响到了免疫相关通路，最后利用crispr cas9 构建目标差异的野生型和突变型细胞系，实验验证免疫细胞的活性。

PBRM1基因在之前的肾癌基因组研究中突变率接近40%，而其所在的染色体变化如3p丢失占到了90%以上，几乎覆盖了透明细胞肾癌病人。该研究把PBRM1的功能性丢失与免疫应答建立了关联，这对相关肾癌病人的肿瘤免疫用药起到了临床指导作用。同时，同期的哈佛大学刘小乐教授团队也报道了PBRM1编码蛋白质的PBAF复合物功能性丢失，增多了作用于IFNy相关基因的启动子和增强子区域转录因子的染色质位点，从而提升了肿瘤细胞对IFNy的敏感性，最后提高了患者的免疫应答水平。由此可见，在基因组研究早期，我们对于PBRM1等显著突变的认知只存在于其会促进肿瘤的发生发展，而随着肿瘤免疫疗法的兴起，其在肿瘤治疗方面还会存在积极作用，这提示我们，对于以往的基因组变化，我们以前看负面的事件，可能还会存在积极的一面，正所谓阴阳相生，希望在此基础上，对肿瘤免疫尤其是抵抗机制有更深入全面的研究，造福广大肿瘤患者。

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讨论

癌症进化是一个复杂多变的命题，癌细胞会根据周围的微环境，随着其改变而不断适应进化。它既具有偶然性，因为它的突变方向不可预知，同时它又有收敛性，纵使它千变万化，最终突变造成的功能紊乱却总是发生在类似的生物学通路上。可以确定，我们可以通过对治疗前和治疗后的病人多次取样，或者不同转移灶进行多区域取样，针对不断变化的癌症，解码其进化路线和关键突变，在早期即针对性进行预防或抑制，同时以此为基础设计panel，对于未来潜在的变化如抗药性，疗效评估，手术效果评估等，我们能通过ctDNA等液体活检技术实时监测其发展，最后结合肿瘤新抗原预测，免疫组库测序，CRISPR-Cas9实验验证，把肿瘤基因组层面发现应用于肿瘤的临床治疗，真正实现肿瘤的个体化药物开发和精准治疗。