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结构域间距和空间构型决定双特异性抗体的效力
2020-12-01 访问次数:584
       导语:近年来,双特异性抗体(BsAb)的发展已成为治疗凝血功能缺陷和癌症的一种有前景的策略。T细胞双特异性抗体(BsAbs)将细胞毒性T淋巴细胞与肿瘤细胞结合,诱导其破坏。尽管目前有60多种双抗正在开发中,但诸如域间间距或空间构型等参数的相对重要性在很大程度上是未知的。
       本文中,Santich等剖析了一个对称的二价双抗(IgG-[L]-scFv:anti-CD3单链抗体与轻链融合的抗肿瘤IgG),以探讨价态和空间构型对BsAb诱导的T细胞毒性的重要性。他们的结果显示,在体外和体内,将肿瘤和T细胞结合域放置在BsAb(顺式构型)的同一侧,与将它们定位在相反侧(反式构型)相比,在体外和体内都能产生更强的抗肿瘤活性。此外,在同一个BsAb中使用两个顺式结构进一步提高了细胞毒性(高达2000倍)。此外,与较小的(G4S1)或较大的(CH1-CH2-CH3)间隔相比,单个Ig结构域(CL)分离抗原结合成分显著增强细胞因子释放和体内肿瘤反应。这些发现为改善BsAb的功能提供了指导,并强调了空间构型和双二价作为开发参数的重要性。
       Santich等以IgG-[L]-scFv架构的BsAb为研究对象,其中之一就是单链可变片段(scFv)识别人CD3(huCD3ε)与每个IgG抗体轻链的C末端融合(图1A)。尽管这种设计在体内和体外对多种肿瘤抗原均具有极强的抗肿瘤活性[GD2(13)、CD33(10)、GPA33(11)和HER2(12)],其疗效的基础尚不清楚。通过研究,他们发现:(1)双抗价态对提高其体外细胞毒性具有重要意义;(2)使用单个Ig结构域(CL)分离肿瘤和T细胞结合域可以显著改善体外细胞因子分泌和体内抗肿瘤反应;(3)将肿瘤和T细胞结合域放在BsAb(顺式结构)的同一侧可将细胞毒性作用提高50倍。

图1. IgG-[L]- scFv与常见BsAb设计的体外比较。2+2为紫色,1+1B为蓝色,1+1H为红色。每条曲线代表一个BsAb,每个点代表一个浓度。
一、IgG-[L]-scFv格式比其他常见的BsAb设计更有效
       Santich等通过将IgG-[L]-scFv结构与广泛用于T细胞重定向应用的两种BsAb结构进行比较来进行研究:双特异性T细胞衔接器(BiTE;与FDA批准的博纳吐单抗(Blinatumomab)结构相同)和IgG异二聚体(图 1A)。使用人源化的3F8(hu3F8)和人源化的OKT3(huOKT3)的可变域序列,分别设计每个BsAb识别肿瘤细胞上的神经节苷脂GD2(GD2)和T细胞上的huCD3ε。BiTE和IgG-[L]-scFv BsAb均使用标准的哺乳动物表达和亲和纯化方法生产,而IgG异二聚体是通过两种不同的IgG同二聚体(hu3F8 IgG和huOKT3 IgG)的受控Fab臂交换制得。对于这些亲本IgG分子中的每一个,都引入了两个Fc突变之一(带有K409R的hu3F8或带有F405L的huOKT3),以促进它们在还原条件下的单体化和优先异二聚化(图1B)。
       通过流式细胞术评估与表达抗原的细胞的结合(图1C),用识别了抗huCD3β(以测量GD2结合)或抗GD2的抗独特型抗体检测结合的BsAb(测量CD3结合)的每个BsAb。在此,就最大有效浓度和半最大有效浓度(EC50)而言,2+2结合的GD2+人类M14黑色素瘤细胞比1+1H或1+1B更有效,而所有三种形式均与激活的人类T细胞(huATC)类似地结合。
       体外细胞毒性试验(图1D)显示,2+2的效力是1+1H的500倍以上,效力是1+1B的20倍以上。这些结果表明2+2相对于1+1H的细胞毒性优势至少部分归因于分子的形式。
       接下来,他们研究了2+2在体外增强的效力是否会转化为更强的体内抗肿瘤活性(图2)。首先,他们使用了免疫缺陷的异种移植小鼠模型IL-2rg−/−Rag2−/−BALB/c双敲除(DKO)小鼠(图2A)。DKO小鼠被皮下植入人类黑色素瘤(M14)、静脉注射huATCs和BsAbs。2+2具有较强的抗肿瘤活性,可缩小大型肿瘤(高达1000mm3),而1+1H相对于对照组BsAbs (一种针对无关肿瘤抗原的IgG-[L]-scfv)没有作用(图2B)。

图2. IgG- [L] -scFv与常见BsAb设计的体内比较。2+2为紫色,1+1H为红色,对照BsAb为灰色。

       2+2和1+1B在体内的药代动力学特性差异很大,这使得两者的比较变得复杂;1+1B的血清半衰期为15分钟(18),而2+2的半衰期为3天。为了解决这个问题,他们使用了离体的“武装”T细胞(EAT)异种移植模型,其中huATCs先与BsAbs结合,洗涤后再注射到成神经细胞瘤患者衍生的异种移植(PDX)的DKO小鼠中。目的是创造嵌合抗原受体(CAR)样T细胞,在过继转移前获得其与肿瘤结合的潜能。它们随后抗肿瘤功能上的任何差异都可能直接与用来“武装”它们的BsAb的细胞毒性效力有关。在这些实验中,对2+2、1+1B和1+1H预孵育方案进行了优化,使所有EATs都含有相当数量的抗GD2结合结构域。3个BsAbs在37℃的体外条件下与huATCs稳定结合达3天,表明EATs可以被当作CAR样T细胞处理。然而,在体内,2+2 EAT具有强大的抗肿瘤活性,而1+1H和1+1B EAT均未显示任何益处。这些结果证实了2+2的增强功效,并证明其优势并不仅仅来自其药代动力学。综上,他们的体外数据和三种不同的动物模型的结果表明,IgG-[L]-scfv结构比BiTE或IgG异源二聚体结构具有更强的抗肿瘤反应。
二、域间间隔对于IgG- [L] -scFv格式的抗肿瘤活性至关重要
      接下来,他们评估了另外两种双二价BsAb结构(图3A),一种是IgG-[H]-scfv (2+2HC)和一种基于IgG1的人BiTE-Fc (2+2B)。与使用单个Ig结构域(CL)分离肿瘤和T细胞结合成分的2+2相反,2+2HC通过融合每个抗huCD3 scFv将间隔增加到三个Ig结构域(CH1-CH2-CH3)每个抗GD2重链的C末端。相反,2+2B在每对scFv之间使用一个短的(G4S1)连接子来减少肿瘤和T细胞结合区域之间的距离。在流式细胞术检测中,三种BsAb与GD2+人M14黑色素瘤细胞相比较(图3B);但是,它们与T细胞的结合却出乎意料地不同。2+2B最有效地结合,相对于2+2和2+2HC,最大结合和EC50均显示出增强。2+2HC表现出比2+2大10倍的T细胞结合能力,具有相当的最大结合能力。这些结果表明,结构域间的间距对于T细胞的紧密结合至关重要,并暗示,与2+2B结构不同,2+2和2+2HC可能不能一致的二价CD3结合。

图3.双二价BsAb设计的比较。橙色代表抗huCD3(源自huOKT3),蓝色代表抗GD2域(源自hu3F8)。2+2为紫色,2+2B为蓝色,2+2HC为绿色。
       出乎意料的是,与2+2相比,2+2B和2+2HC均表现出较2+2降低的体外细胞毒性(图3C),与2+2相比,2+2的溶解度降低了约2-3倍(分别为80和140fM EC50,而2+2中为38fM)。为了进一步研究体外功能的这些差异,他们使用T细胞活化和细胞因子释放作为下游读数,对未加工的人类T细胞和GD2+M14黑色素瘤细胞进行了共培养测定(图3D)。就总体反应和效力而言,与2+2HC或2+2B相比,2+2诱导的白介素2(IL-2)细胞因子释放明显增强。2+2还引起早期反应表面标记CD69和CD25的更强上调,证实2+2激活的T细胞比2+2B或2+2HC更有效。在没有肿瘤细胞的情况下,BsAbs均未诱导可测量的细胞因子释放或T细胞激活,表明这些反应完全依赖于抗原。

图4. 双二价BsAb设计的体内比较。2+2为紫色,2+2B为蓝色,2+2HC为绿色,对照组(无BsAb)为灰色。
       为了确定结构域间距对体内肿瘤反应的影响,他们使用两种常规方法比较这三种结构(图4)。在这两种方法中,只有2+2激发了强大的抗肿瘤反应,而2+2B和2+2HC显示出的效果与对照组相差不大。这些结果是出乎意料的,他们提出两个观点:①光凭二价不足以产生强大的抗肿瘤效力;②结构域间距的减小不一定会增加细胞毒性。相反,2+2设计的优越性表明,最优的结构域间距和空间构型对于体内外抗肿瘤反应的产生至关重要。
三、价态可提高IgG-[L]-scFv结构的肿瘤和T细胞结合
       为了确定具有显著抗肿瘤活性的IgG-[L]-scFv结构的特性,Santich等设计了四种新的IgG-[L]-scFv异源二聚体(图5),它们代表了所有可能的价和结构域间空间构型的组合。

图5. 系列IgG- [L] -scFv的体外结合活性。图A、B中,橘色域代表anti-huCD3、蓝色领域代表anti-GD2、黑色条纹域代表无关anti-CD33。图D:共轭分析原理图(左)和结果图表(右)。未共轭细胞(左上和右下象限)在一个通道下显示荧光,而共轭细胞(右上象限)在两个通道下显示荧光。分析时,以偶联T细胞在总T细胞中的比例(红色方框)来测量偶联频率。2+2为紫色,1+1H为红色,2+1为蓝色,1+1T为绿色,1+1C为棕色,1+2为橙色,对照BsAb为灰色。
       SPR(surface plasmon resonance,表面等离子体共振)及流式细胞术测定结果均显示,二价BsAb比单价BsAb更能与细胞相关抗原结合(图5C)。为了评估当两种抗原同时结合时,与GD2和huCD3结合的差异是如何产生的,他们进行了体外细胞-细胞结合试验(图5D)。流式结果显示,2+2在本实验中最有效,其次是2+1,其余结构(1+2、1+1T、1+1C和1+1H)的活性明显降低。
       这些结果表明,二价体,特别是对肿瘤的作用,改善了结合物的形成,是细胞毒性的重要一步。1+1C和1+1T结合抗原或诱导结合物的能力差异不明显,说明肿瘤和T细胞结合域的空间构型不影响结合物的形成。
四、空间构型决定IgG-[L]-scFv的体内外功能
       M14黑色素瘤细胞的体外细胞毒性试验显示,系列IgG-[L]-scFv存在显著差异(图6A)。2+2诱导的抗肿瘤细胞毒性最强(26fM,EC50),其次是2+1(240fM,EC50)和1+2(773fM,EC50),分别是9倍和30倍。

图6. 系列IgG-[L]- scFv体外功能活性研究。2+2为紫色,1+1H为红色,2+1为蓝色,1+1T为绿色,1+1C为棕色,1+2为橙色,控制组BsAb为灰色。
       为了探索价数和空间构型的差异如何影响原始T细胞活化,他们使用体外共培养测定法比较了系列IgG-[L]-scFv(图6,B至F)。IL-2的分泌再次揭示了不同BsAb变体之间的主要差异。2+2引起的IL-2分泌明显比所有其他BsAb更强,显示出比下一个最具刺激性的变体高近100倍的效力(图6B)。2+1、1+2和1+1C表现出中等效力,1+1T和1+1H在检测下限附近诱导弱的IL-2分泌。T细胞的活化和增殖通常遵循相同的等级顺序,尽管差异较小,并且对于CD4+和CD8+T细胞子集均保持一致(图6,C-F)。2+2显示出最高的效价,而1+1T始终是最弱的,与1+1H没有区别,刺激性比2+2低约200倍。2+1、1+2和1+1C通常以中等强度聚集在一起,其中2+1显示出更有效的激活,然后依次是1+2和1+1C。如前所述,与BsAb一起孵育但没有肿瘤细胞的T细胞没有表现出任何可测量的反应,表明BsAb介导的T细胞活化是抗原依赖性的。
       1+1C和1+1T之间的显著性差异表明,抗原结合结构域的空间构型是体外BsAb活性的关键决定因素。此外,尽管2+2在2+1和1+2上显示出更高的效力,但2+1和1+2都不优于1+1C。因此,当抗原结合域的增加创造了一个额外的顺式结构时,它最有效地改善了效力。总之,这些数据表明,IgG-[L]-scFv框架内的双重二价通过改善细胞结合并以顺式结构呈递肿瘤和T细胞结合来增强BsAb功能。
       在带有皮下人黑素瘤(M14)肿瘤并用BsAb和huATC治疗的DKO小鼠中(图7A),2+2再次显示出最强的抗肿瘤活性(图7B)。2+1最初对2+2引起相似的反应,但最终的持久性较差,治疗结束后肿瘤迅速复发。与体外功能研究一致,1+2和1+1C均显示中等的抗肿瘤活性,但明显比2+1和2+2差。最后,相对于用对照BsAb治疗的小鼠,1+1H和1+1T均未显示任何抗肿瘤功效。

图7. 系列IgG-[L]-scFv的体内抗肿瘤活性。2+2为紫色,1+1H为红色,2+1为蓝色,1+1T为绿色,1+1C为棕色,1+2为橙色,控制组BsAb为灰色。
       总体而言,这些结果与他们的体外研究结果一致,并证实了顺式结构的肿瘤和T细胞结合域的重要性。
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内容来源:
Santich B H, Park J A, Tran H, et al. Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies[J]. Science Translational Medicine, 2020, 12(534).


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